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Bioss流式講堂｜多色搭配大師懂這些就夠了

發表者：北京博奧森生物發表時間：2018-10-30

知識要點：熒光標記的流式抗體種類繁多，熒光素的激發光譜與發射光譜各異，給抗體選擇、熒光搭配等帶來了諸多困擾。需要注意：熒光素的激發波長需要與可激發發光的激光器匹配，熒光素的激發光譜峰值盡可能接近儀器激光的激發光波長。此外，熒光素的激發波長必須選用相應波段檢測器接收，以達到同時檢測的目的。

熒光素的搭配依據

流式抗體熒光標記搭配主要由3個因素決定：流式細胞儀檢測的通道數、需要同時檢測的熒光抗體數、廠家抗體的熒光種類及數目。
（1）激光管數目以及每根激光的功能決定檢測的通道數量，即可同時檢測的指標數量。注意以下兩點：
① 流式細胞儀有哪些激光。比如標配的FACSCalibur只有一根488nm的激光，能做FL1/ FL2/ FL3三個顏色；而選配的FACSCalibur配有488nm和635nm兩根激光，能做FL1/ FL2/ FL3/ FL4四個顏色。
② 不同型號的儀器同一通道檢測熒光素的能力是不一樣的，比如FACSCalibur的FL3能檢測PE-Cy5/PerCP/PerCP-Cy5.5/PE-Cy7，而Aria只能檢測PE-Cy5/PerCP。

（2）需要同時檢測的指標數量超過了儀器能力范圍：拆開分管標記。如下例，

計劃檢測5個指標，而流式細胞儀只有4個通道，首先將指標歸成2類，再將樣本分成2份，分別檢測。如同時檢測CD3、CD4、CD8、IL-4和IFN-gamma，那么將樣本分成兩份，第1份加CD3、CD4、CD8和IL-4，而第2份加CD3、CD4、CD8和IFN-gamma。

（3）廠家提供的熒光素種類及數目：供應商能提供的每種抗體的熒光素是不一樣的。盡量選擇說明書中有流式圖的抗體。

不同型號流式細胞儀的檢測通道及可應用的熒光素^[1]

熒光素搭配原則:
（1）根據儀器選擇熒光素
① 每個通道只能選擇一個熒光素
以calibur為例，FL1選擇了FITC就不能選擇AlexaFluor488; FL3可檢測PE-Cy5 / PerCP / PerCP-Cy5.5等5種熒光，但熒光搭配時只能選擇一種熒光被此接收器檢測。
② 各通道之間熒光素可隨意搭配
如果流式細胞儀有4個通道，每個通道選出1個熒光素就可以組成4個顏色。
（2）搭配的熒光素之間發射光譜重疊盡量小
熒光的最大發射波長相差越大，熒光重疊就越小，這是由熒光光譜特征決定的。另外，不建議聯用APC和Cy5串聯熒光，因為他們之間光譜重疊較大，熒光補償不易調節。

4色以內流式分析熒光素抗體組合

PerCP

FITC、PE

PE-Cy5

FITC、PE

PE-Cy5.5

FITC、PE、APC

PE-Cy7

FITC、PE、APC

6色、8色、10色流式分析熒光素抗體組合

6色	8色	10色
FITC或Alexa Fluor 488	FITC FITC 或Alexa Fluor 488	FITC或Alexa Fluor 488
PE	PE	PE
		PE-Texas Red或PE- Alexa Fluor610
PerCP-Cy5.5	PerCP-Cy5.5	PerCP-Cy5.5
PE-Cy7	PE-Cy7	PE-Cy7
APC或Alexa Fluor647	APC 或 Alexa Fluor647	APC 或 Alexa Fluor647
		APC或Alexa Fluor680或Alexa Fluor700
APC-Cy7或APC-H7	APC-Cy7或APC-H7	APC-Cy7或APC-H7
	AmCyan或BD Horizon V500	AmCyan或BD Horizon V500
	BD Horizon V450	BD Horizon V450

熒光選擇注意事項:
1.選擇熒光素應考率的因素
① 抗原密度：高表達抗原可以選擇任何熒光素標記的抗體檢測，低表達的抗原需要用較量熒光素（如PE/APC）標記的抗體檢測，從而達到有效區分陰性細胞和陽性細胞的目的。
② 降低自發熒光：選擇高波長范圍里的熒光染料，自發光在高波長范圍里（＞600nm）迅速降低。

2.應用FITC標記抗體避免使用酸性緩沖液
應用FITC標記抗體時，避免使用酸性緩沖溶液，因為FITC的熒光特性是PH依賴性的。

3.串聯染料確保未發生解偶聯
串聯染料有可能會發生解偶聯，對“光漂白”和使用固定劑的“固定時間”更加敏感。建議設置一個“串聯染料單染”作為對照，并在其他通道檢測熒光的情況作為對比，以確保未發生解偶聯。例如，應用PE/Cy5單染做對照時，分析PE通道的熒光信號。
[1] 劉艷榮. 實用流式細胞術. 北京：北京大學醫學出版社，2017（3-39）.

PerCP	FITC、PE
PE-Cy5	FITC、PE
PE-Cy5.5	FITC、PE、APC
PE-Cy7	FITC、PE、APC

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