化學發光分析技術簡介
一、 免疫學檢測發展階段
免疫學檢測主要是利用抗原和抗體的特異性反應進行檢測的一種手段，由于其可以利用同位素、酶、化學發光物質等對檢測信號進行放大和顯示，因此常被用于檢測蛋白質、激素等微量物質。我國免疫學的檢測基本歷經了以下幾個過程，如圖1.1 所示。
盡管免疫診斷在臨床診斷中占據著非常重要的地位，但是從我國臨床免疫診斷現狀來看，無論是臨床應用方面，還是產業化角度，都處于相對比較落后的狀態，亟待改進。下表１.１就此做一比較：
表 1.1 中國免疫診斷現狀
二、化學發光免疫分析技術及其優勢
【概述】
本世紀 70 年代中期Arakawe 首次報道用發光信號進行酶免疫分析，利用發光的化學反應分析超微量物質，特別是用于臨床免疫分析中檢驗超微量活性物質。目前，這一技術已從實驗室的稀有技術過渡到臨床醫學的常規檢測手段。化學發光免疫分析（Chemiluminescence Immunoassay，CLIA）是將化學發光或生物發光體系與免疫反應相結合，用于檢測微量抗原或抗體的一種新型標記免疫測定技術。其檢測原理與放射免疫（RIA）和酶免疫（EIA）相似，不同這處是以發光物質代替放射性核素或酶作為標記物，并藉助其自身的發光強度直接進行測定。
化學發光免疫分析既具有放射免疫的高靈敏度，又具有酶聯免疫的操作簡便、快速的特點，易于標準化操作。且測試中不使用有害的試劑，試劑保持期長，應用于生物學、醫學研究和臨床實驗診斷工作，成為非放射性免疫分析法中最有前途的方法之一。
【原理】
在化學發光免疫分析中包含兩個部分，即免疫反應系統和化學發光系統。免疫反應系統，其基本原理同酶聯免疫技術（ELISA），常采用雙抗體夾心法、競爭法、間接法等反應模式，如圖1.2，1.3，1.4 所示。
圖 1.2 雙抗體夾心反應原理示意圖
圖 1.4 競爭法（阻斷法）反應原理示意圖
化學發光系統的原理在于免疫反應中的酶作用于發光底物。發光底物在酶的作用下，底物發生化學反應并釋放出大量的能量，產生激發態的中間體。這種激發態中間體，當其回到穩定的基態時，可同時發射出光子。利用發光信號測量儀器即可測量光量子產額，該光量子產額與樣品中的待測物質的量成正比。由此可以建立標準曲線并計算樣品中待測物質的含量。
（1）與放免（RIA）產品比較
與放射免疫試劑（RIA）比較，化學發光避免了放射性核素的污染以及對操作人員的傷害，大大縮短了反應時間，同時兼具高靈敏度的優勢。
（2）與酶免（ELISA）產品比較
靈敏度與可測范圍遠遠高于酶免產品，兼具ELISA 法簡便的操作方法與較短的反應時間。
三、化學發光常用的化學試劑及其原理
化學發光是某種物質分子吸收化學能而產生的光輻射。任何一個化學發光反應都包括兩個關鍵步驟，即化學激發和發光。因此，一個化學反應要成為發光反應，必須滿足兩個條件：第一：反應必須提供足夠的能量（ 170 ~300KJ/mol ） ，第二，這些化學能必須能被某種物質分子吸收而產生電子激發態，并且有足夠的熒光量子產率。到目前為止，所研究的化學發光反應大多為氧化還原反應，且多為液相化學發光反應。
化學發光反應的發光效率是指發光劑在反應中的發光分于數與參加反應的分子數之比。對于一般化學發光反應，值約為 10-6，較典型的發光劑，如魯米諾，發光效率可達0.01 ，發光效率大于 0.01 的發光反應極少見。現將幾種發光效率較高的常用的發光劑及其發光機理歸納如下。
1. 魯米諾及其衍生物
魯米諾的衍生物主要有異魯米諾、 4-氨基已基-N-乙基異魯諾及 AHEI 和 ABEI 等。魯米諾在堿性條件下可被一些氧化劑氧化，發生化學發光反應，輻射出最大發射波長為 425nm 的化學發光。
在通常情況下魯米諾與過氧化氫的化學發光反應相當緩慢，但當有某些催化劑存在時反應非常迅速。最常用催化劑是金屬離子，在很大濃度范圍內，金屬離子濃度與發光強度成正比，從而可進行某些金屬離子的化學發光分析，利用這一反應可以分析那些含有金屬離子的有機化合物，達到很高的靈敏度。其次是利用有機化合物對魯米諾化學發光反應的抑制作用，測定對化學發光反應具有猝滅作用的有機化合物。其三是通過偶合反應間接測定無機或有機化合物。其四是將魯米諾的衍生物如異魯米諾 (ABEI) 標記到羧酸和氨類化合物上，經過高效液相色譜 (HPLC) 或液相色譜 (LC) 分離后，再在堿性條件下與過氧化氫－鐵氰化鉀反應進行化學發光檢測。也可以采用其它分離方法，如將新合成的化學發光試劑異硫氰酸異魯米諾標記到酵母 RNA 后，通過離心和透析分離，然后進行化學發光檢測。此外應用的還有 N 2(B2 羧基丙酰基 ) 異魯米諾，并對其性能進行了研究。
2. 光澤精
光澤精以硝酸鹽的形式存在，在堿性介質中，過氧化氫將其氧化成四元環過氧化物中間體，而后裂解生成激發態的吡啶酮而發光。利用光澤精與還原劑作用，可用于測定臨床醫學上一些重要的還原性物質，如抗壞血酸、肌酸酐、谷胱甘肽、葡萄糖醛酸、乳糖、葡萄糖。
3. 洛粉堿
洛粉是文獻上記載最早的化學發光試劑，但卻遲遲未得到應用，直到 1979 年 Marino 等人將它應用于 Co 的測定后才得到重視。此試劑已被用于多種元素的分析測定。
4. 過氧化草酸酯類
草酸鹽類化學發光反應大都生成過氧草酰 (Peroxalate) 中間體，因此這類反應亦稱過氧草酰類化學發光反應。過氧草酸鹽類化學發光分析應用的推廣還有賴于新的熒光衍生試劑的開發。
5. 吖啶酯類
McCap等合成了一系列吖啶酯類化合物，對該類試劑的化學發光機理研究表明，發光效率與試劑中的可解離酸性基團的pKa有密切關系,pKa一般應小于11 。吖啶酯類化合物是一類很有前途的非放射性核酸探針標記物，用作 DNA 的發光探針，發光量子產率高，穩定性好，標記物對雜交反應的動力學和雜交體的穩定性無影響，可以直接在堿性介質中進行化學發光反應。
以上五種化學發光劑化學發光量子產率高，水溶液穩定，能被多種氧化劑直接氧化而發光，也可被眾多的金屬高于催化發光反應而發光，許多無機、有機和生化組分也能增強或抑制其發光，因此應用十分廣泛。目前報道的有鄰菲咯啉，堿基水楊酸、羅明丹 —B 、沒食子酸、香豆素、皮素，茜素紫、蘇木色精，培花青，三苯甲烷類染料，丙酮、乙醇、羥胺等。這些試劑商品化程度高，價廉，使用方便，但化學發光量子產率較低，因此，研究增敏試劑來提高它們的化學發光量子產率是非常關鍵的。
四、化學發光的應用
1. 無機化合物化學發光分析
1.1 金屬離子分析
痕量金屬離子對化學發光反應具有很好的催化作用，因而化學發光測定金屬離子得到廣泛的應用。但是，由于不同金屬離子催化氧化發光試劑時，發光光譜相同，致使金屬離子催化化學發光反應的選擇性較差。為提高分析的選擇性，可采用以下方法 : (1) 利用待測金屬離子與干擾離子配合物穩定性不同進行選擇性分析，如加入掩蔽劑 EDTA 或水楊酸掩蔽干擾離子 ; (2) 優化實驗條件以減少其它離子的干擾 ; (3) 稀釋樣品溶液 ;(4) 加入敏化劑。但是，當樣品中待測物相對于干擾物濃度很小時，上述方法也無濟于事，只得進行前處理，常用的分離方法有色譜、溶劑萃取等。
色譜分離的高選擇性與化學發光檢測的高靈敏度相結合，是一種很有前途的聯用技術。關鍵是流動相的選擇，流動相選擇得好，不僅可以提高選擇性，還可以進行多個離子的同時測定。如用離子交換分離法同時測定 Cr (à ) 和 Cr (? ) 。溶劑萃取也是提高化學發光測定金屬離子選擇性的一個有效方法。這種方法的主要問題是費時，因為進行化學發光檢測前必須將無機物從有機溶劑中反萃取出來，或是將有機溶劑蒸發除去。較好的方法是自動在線溶劑萃取選擇性檢測待測物。
1.2 其它無機化合物的分析
化學發光反應中，過氧化氫是最常用的一種氧化劑，因此有關 H 2 O 2 化學發光分析的報道較多，涉及到魯米諾、過氧草酸酯及光澤精等化學發光反應。根據魯米諾化學發光反應制成的 H2O2 光纖傳感器與流動注射法聯用，可檢測 10nmo l /L~1 mmo/L 的 H2O2 ，用模擬酶代替辣根過氧化物酶催化魯米諾發光，檢測限可達 5 . 5×10 - 9 mo l /L 。根據 ClO - 對魯米諾的氧化作用，可用于測定 ClO - ，其它物質如 Cl 2 的干擾，可用流動注射法消除。利用停流技術測定水中 ClO - 不必進行前處理。含氮的無機化合物如 NH3/NH +4 ，可將其衍生后用 TCPO 化學發光法檢測，線性范圍為 2.9ug /L ~6 m g /L 。 CN － 能抑制魯米諾 H 2 O 2 － Cu (II ) 的化學發光，據此可分析測定 CN — 。在低溫條件下化學發光分析測定 CN － ，當進樣量為 100uL 時，線性范圍為 10-9－ 10 -7 g ／ mL ，當進樣量 20 uL 時，線性范圍為 10-8 ～ 5×10 -7 g ／ mL 。
2. 有機化合物的化學發光分析
2.1 有機酸
有機化合物的同系物結構和性質相似，使單一組分的測定遇到困難，因此有機化合物同系物的分析常與 HPLC 相結合。有機酸的化學發光分析 ，一般是先將其衍生成熒光物質經色譜分離后進行化學發光檢測。但衍生法有如下的缺點 : (1) 衍生反應不完全 ; (2) 衍生物穩定性差，要求及時檢測 ; (3) 限制了分離方法和條件的選擇。由于衍生產物的性質與待測物不同，導致分離效率和分辨率下降，同時增加分析的時間和勞動強度。在臨床醫學上，草酸是一個重要的檢測項目，可以直接用氧化化學發光反應測定尿液和草酸二乙酯中的草酸鹽及游離的草酸。另外還可以測定苯酮尿癥病人的尿液的苯丙酮酸的含量，方法是先在堿性條件下將苯丙酮酸氧化成 1,22 二氧雜環丁烷類化合物，然后裂解產生化學發光。另外可以將 Fe （ III ）草酸配合物光解得到 Fe (II ) ，催化魯米諾－過氧化氫化學發光反應，此法線性范圍為0.1～ 100uM 。此外酶聯偶合反應也可以用于某些有機酸的化學發光分析。
2.2 有機堿
胺類化合物第一離子化電勢呈如下規律 : 伯胺 > 仲胺 > 叔胺，并隨碳鏈增長，離子化電勢逐漸下降，因此叔胺化合物的檢測限較低，達 0 . 28 pM 。胺類化合物的分析，較多的是經柱前衍生生成熒光衍生物，分離后用過氧草酸鹽化學發光體系檢測，也可將其生成希夫堿或其它產物氧化而發光。有些堿如腎上腺素等可直接氧化而發光。通常有一個經驗規則，假如一物質具有熒光或其反應產物有熒光，該物質一般可發生化學發光反應，但也有例外。嘌呤堿是核酸的基礎物質，因此對嘌呤堿的分析測定將推動 DNA 分析方法的發展。在酸性醇液中腺嘌呤與苯甲醛反應，然后用過氧化氫氧化反應產生化學發光，此法具有很好的選擇性，線性范圍為 1 . 5×10-7～ 5 . 0×10-7M ，用此法測定鳥嘌呤靈敏度比熒光法高 20 倍。
2.3 氨基酸
氨基酸分析方法的改進有利于推動生物技術、基因工程、 DNA 重組和基因克隆等的發展。由于絕大多數氨基酸沒有內源熒光特性，因此用過氧草酸鹽體系測定氨基酸需將其衍生成熒光物質，但此法避免不了衍生法所固有的缺點。此外亦可通過測定氨基酸與氨基酸氧化酶反應產生的過氧化氫來測定氨基酸的含量，如 L 2 氨基酸經反相色譜柱分離后流經 L 2 氨基酸氧化酶反應器產生過氧化氫，然后用過氧草酸鹽體系檢測。氨基酸與 Ru (b ipy) 3+3 反應，用流動注射化學發光法檢測，相對于脯氨酸和天冬酰胺檢測限可分別達到 20 pmo l 和 50 pmo l 。一般來說，仲胺反應產生的的發光強度比伯胺大。對氨基酸上取代基性質研究表明，給電子基有利于增強化學發光強度。
2.4 糖類
光澤精體系可用于測定一些還原性物質，如乳糖、葡萄糖，用于抗壞血酸和脫氫抗壞血酸的分析測定有很高的靈敏度。但此法用于復雜樣品分析卻因干擾多而受到限制。用草酰胺化學發光照相法測定了葡萄糖。在微量滴定板上將草酰胺發光劑、熒光增感劑及 50 uL 試樣混合，于 5 m in 內用照相熒光劑測定液斑的發光強度，可檢出 100 pmo l 的萄萄糖。
糖類物質測定的另一個重要方法是測定酶反應產生的 H2O2 ，由此對酶底物 —— 葡萄糖、乳糖等進行測定。而酶的固定化技術為此法的發展注入了新的活力。采用物理包埋法將葡萄糖氧化酶固定在聚丙烯酰胺凝膠中并制成酶柱，再將酶柱接入流動注射系統中，用流動注射化學發光法測定由酶促反應產生的 H2O2 ，從而測定人體血液中的葡萄糖，檢出限可達 0.1 m g /L 。
2.5 類固醇與類酯
一些特異性酶如類固醇脫氫酶和其它熒光素酶與合適底物反應產生 H2O2 ，通過測定 H2O2 達到分析測定底物的目的。
2.6 藥物
根據藥物的不同類型選擇不同的化學發光分析方法。目前較常用的方法是直接氧化化學發光。在堿性溶液中用 N －溴代丁二酰亞銨氧化含有酰胺基的藥物產生化學發光，如利福霉素等檢測限在1.23 m g /L~0.5 g/L 之間。氧化四環素類藥物檢出限在 0 . 02-0 . 04 m g/L 之間。
3. 化學化光在生物領域的應用
化學發光在生物學領域也有著很多應用，主要簡介如下：
3.1 Fe 2 +
離子催化的化學發光自由基啟動的脂質過氧化 (LPO) 是一個鏈式反應過程。 在鏈式反應過程中， Fe 2 + 離子起著啟動和催化的作用。 反應過程中產生脂自由基 (R-) 、烷氧自由基 (RO-) 、共軛二烯和脂過氧化自由基 (ROO-) 等中間產物。 ROO-自反應會產生激發的烷氧自由基 (RO3 ) 和單線態氧 (O2 ) ，其回到基態時產生發光。 另外，兩個 O2 分子相互作用也可產生發光。 因此，把 Fe 2 + 鹽加入含有脂肪的系統中，如細胞膜、線粒體、微粒體、血漿、組織勻漿、尿液等，可產生化學發光。 化學發光的動力學曲線，可分為快速閃光期、潛伏期、緩慢發光期和穩定發光期。有報告提出，快速閃光期的發光強度與樣品中過氧化氫含量有關，潛伏期的長短與樣品中抗氧化劑含量有關，而緩慢發光期和穩定發光期的發光強度則反映了系統的過氧化水平，即系統產生活性氧的能力。
3.2 血漿和血清的化學發光
許多實驗研究對加入 Fe 2 + 鹽的不同疾病患者血漿和血清的化學發光進行的測量表明，與正常健康人相比，腹腔器官局部缺血、肢端閉合性局部缺血、血氧含量下降以及出血、手術性休克病人血漿和血清的發光強度降低。 與此相反，風濕性關節炎、闌尾炎、膽囊炎、胰腺炎等炎性疾病患者血漿和血清的發光強度升高。 降低和升高的幅度與疾病的嚴重程度有關。 有研究提出，利用此方法有可能對非典型的心肌梗塞和腹腔器官炎性疾病做出區別診斷。
3.3 血漿脂蛋白的化學發光
有研究提出，以分離的血漿脂蛋白懸液作為系統模型可以研究不同物質對系統過氧化的調節機制。在分離的血漿脂蛋白懸液中加入膽固醇，溫育一定時間后在加入 Fe 2 + 鹽，測量化學發光，發現膽固醇能使系統的發光強度降低。分析認為，這可能是由于類固醇的存在抑制了系統的過氧化。對實驗性膽固醇過多血癥家兔和動脈粥樣硬化早期病人進行的測量發現，載脂蛋白 APO – B 。在 Fe 2 + 存在條件下的發光強度出現了增長。同樣的現象在肝硬化和慢性肝炎患者身上也被發現。
3.4 尿液的化學發光
利用尿液的化學發光可以研究腎臟功能的變化。將 Fe 2 + 鹽加入尿液中，測量其化學發光，發現腎功能不足者尿液的發光強度降低。與正常健康人相比，闌尾炎患者尿液的發光強度則有不同程度的提高。利用這一方法可以評估腎臟的排泄及收縮功能。
3.5 物質抗氧化活性的測定
利用發光測量技術可以評價某些生物組織和體液的抗氧化活性。以某一穩定的發光系統為模型，如脂肪體、線粒體、卵黃脂蛋白等，將待測的抗氧化物質加入該系統，然后加入 Fe 2 + 鹽，測量其化學發光。 根據系統化學發光被抑制的程度可以評價物質的抗氧化活性。 利用這一方法進行的研究證明，不同疾病患者血漿和血清的抗氧化活性是不同的。
3.6 H2O2 激發的化學發光
3.6.1 血漿和血清的化學發光
在血漿和血清中加入 H2O2 溶液后能激發化學發光。有報告提出，發光強度與血漿中血紅素的水平呈線性相關，相關系數為 + 0. 71 。在上述發光系統中，加入過氧化氫酶或松香油后，發光被抑制，加入疊氮化鈉 (NaN3 ) 后，發光幾乎完全消失。 H2O2 激發的血漿和血清的化學發光，其啟動因素很可能是血紅素過氧化物酶催化 H2O2 分解引起的。血紅素過氧化物對 H2O2 的分解是以 H2O2 氧化其底物為前提的。在這一反應過程中導致自由基及其中間產物生成，并與機體分子相互作用，產生 O2 等活性物質，產生發光。 NaN3 和松香油是 O2 的抑制劑，所以在上述發光系統中加入松香油的 NaN 3 后，發光被抑制。血液中血紅素過氧化物酶等以自由基方式分解 H2O2 ，而過氧化氫酸則以非自由基方式分解 H2O2 ，生物體內這兩類反應體系協同作用，能很好的清除細胞內的 H2O2 。病理條件下，這一反應體系的平衡被破壞， H2O2 激發的化學發光強度將發生相應改變。因此，根據血漿和血清化學發光的變化，有可能對某些疾病進行區別診斷。
3.6.2 紅細胞的化學發光
1981 年 Cepгиеко 等人在分離出的紅細胞懸液中加入 H2O2 溶液，對其化學發光進行測量。 發現，隨著紅細胞的老化和溶解，系統發光強度呈增長趨勢。隨后對實驗性動脈粥樣硬化家兔紅細胞化學發光進行的測量發現，與正常對照組相比，發光強度出現了降低。這可能是由于細胞膜中膽固純含量過高造成的。對惡性腫瘤患者的調查也發現發光強度的改變。紅細胞的衰老與脂質過氧化有關。 H2O2 能引發膜脂過氧化， H2O2 和脂質過氧化產物都能引起血紅蛋白釋放 Fe 2 + ， Fe 2 + 是誘發一系列自由基反應、起動脂質過氧化的催化劑。自由基的產生不僅促進了紅細胞的衰老和溶解，而且引發的脂質過氧化還可以導致膜脂組分和結構的改變，直接影響紅細胞的生理功能。
