免疫组化Immunohistochemistry
一、概述
1、定义
用标记的特异性抗体对组织切片或细胞标本中某些化学成分的分布和含量进行组织和细胞原位定性、定位或定量研究，这种技术称为免疫组织化学（immunohistochemistry）技术或免疫细胞化学（immunocytochemistry）技术。
2、原理
根据抗原抗体反应和化学显色原理，组织切片或细胞标本中的抗原先和一抗结合，再利用一抗与标记生物素、荧光素等的二抗进行反应，前者再用标记辣根过氧化物酶（HRP）或碱性磷酸酶（AKP）等的抗生物素（如链霉亲和素等）结合，最后通过呈色反应或荧光来显示细胞或组织中化学成分，在光学显微镜或荧光显微镜下可清晰看见细胞内发生的抗原抗体反应产物，从而能够在细胞爬片或组织切片上原位确定某些化学成分的分布和含量。
3、分类
1）按标记物质的种类，如荧光染料、放射性同位素、酶（主要有辣根过氧化物酶和碱性磷酸酶）、铁蛋白、胶体金等，可分为免疫荧光法、放射免疫法、免疫酶标法和免疫金银法等。
2）按染色步骤可分为直接法（又称一步法）和间接法（二步、三步或多步法）。与直接法相比，间接法的灵敏度提高了许多。
3）按结合方式可分为抗原-抗体结合，如过氧化物酶-抗过氧化物酶（PAP）法；亲和连接，如卵白素-生物素-过氧化物酶复合物（ABC）法、链霉菌抗生物素蛋白-过氧化物酶连结（SP）法等，其中SP法是比较常用的方法；聚合物链接，如即用型二步法，此方法尤其适合于内源性生物素含量高的组织抗原检测。
4、实验所用标本
实验所用主要为组织标本和细胞标本两大类，前者包括石蜡切片（病理切片和组织芯片）和冰冻切片，后者包括组织印片、细胞爬片和细胞涂片。其中石蜡切片是制作组织标本最常用、最基本的方法，对于组织形态保存好，且能作连续切片，有利于各种染色对照观察；还能长期存档，供回顾性研究；石蜡切片制作过程对组织内抗原暴露有一定的影响，但可进行抗原修复，是免疫组化中首选的组织标本制作方法。
5、实验所用抗体
免疫组化实验中常用的抗体为单克隆抗体和多克隆抗体。单克隆抗体是一个B淋巴细胞克隆分泌的抗体，应用细胞融合杂交瘤技术免疫动物制备。多克隆抗体是将纯化后的抗原直接免疫动物后，从动物血中所获得的免疫血清，是多个B淋巴细胞克隆所产生的抗体混合物。
二、免疫染色
下面以石蜡切片的免疫组化为例演示详细操作流程（SP法）:
1.60℃烤片2小时
2.脱蜡。二甲苯脱蜡15分钟，三次
3.水化。依次经过无水乙醇、95%、90%、80%、70%，各5分钟，蒸馏水（或自来水）5分钟
4.PBS（洗液C-0079）洗5分钟，三次
5.抗原修复。枸橼酸缓冲液（修复液，C-0070）（约92-95℃）煮沸（沸水浴）修复15分钟，自然凉至室温。PBS洗5分钟，三次
6.3%双氧水（包含在SP-0023中）消化内源性的过氧化物酶，20分钟，PBS洗5分钟，三次
7.正常山羊血清（包含在SP-0023中）封闭，37℃20分钟
8.一抗孵育，4℃过夜. （抗体稀释液C-0007）
9.PBS洗5分钟，三次
10.二抗孵育，37℃20分钟（二抗为生物素标记的羊抗兔IgG，包含在SP-0023中），PBS洗5分钟，三次
11.三抗孵育，37℃20分钟（三抗为辣根酶标记的链霉亲和素，包含在SP-0023中），PBS洗5分钟，三次
12.DAB（显色剂C-0010）显色，镜下观察结果，适时终止
13.苏木素（C-0021）复染5分钟，自来水冲洗片刻，1%的盐酸酒精（75%）溶液（此试剂无法销售，请自行配置，配制比例为：100ml 75%酒精+1ml浓盐酸）分化30秒，自来水冲洗5分钟蓝化
14.脱水。依次经过70%、80%、90%、95%、无水乙醇，各5分钟，二甲苯15分钟，三次
15.封片，中性树胶（C-0073）封片
三、有关免疫组化实验的重要问题
（一）组织材料处理
1.取材要取新鲜组织，大小合适，用生理盐水洗净
2.固定固定就是把病理标本组织浸泡在固定液中（常用的有4%多聚甲醛），使组织或细胞内蛋白质凝聚、沉淀或变性成为不溶性物质，并保持细胞原有的形态结构
3.洗涤固定后一定要把渗透到组织里面的固定液洗去，以利于进行脱水，若组织中留有较多的固定液，则将影响脱水剂，甚至可在组织中发生沉淀而影响后续染色及观察，对于陈旧性标本或固定时间过长的标本，更应注意流水冲洗。
4.脱水脱水必须彻底，若脱水不尽，则切片后组织与空气接触即干燥收缩，蜡块切面出现凹陷现象，虽可勉强切片，但染色效果差，染色时也容易脱落
5.透明乙醇等脱水剂不能溶解石蜡，所以浸蜡之前需要一个既能与乙醇混合又能溶解石蜡的媒剂，以便使石蜡浸入到组织中去，当组织中全部被透明剂占有时，光线可以透过，组织可呈现不同程度的透明状态，此现象称为透明。如果组织不能透明，表明脱水未尽必须重新返工，否则影响到浸蜡的进行，但返工时往往效果不好
6.浸蜡浸蜡时间根据组织的类型可适当调整，一般原则较小组织脱水时间和浸蜡时间较短；骨、肌肉等坚硬组织脱水和浸蜡时间不宜过长；脂肪组织、疏松结缔组织脱水和浸蜡时间需增加
7.包埋包埋时应注意组织的包埋方向，否则将影响组织切片的形态。包埋用的石蜡要和浸蜡用的石蜡熔点一致，包埋用的石蜡温度要稍高于浸蜡的温度。包埋好后可置于冷水中使石蜡迅速冷凝。包埋好的石蜡块应呈均匀的半透明状，如出现白色浑浊则其中存在石蜡的结晶，这种蜡块不能切除薄的切片。可能是组织脱水不充分，组织内或石蜡中混有透明剂，或包埋时动作太慢或石蜡凝固太慢所致，所以冷却时水温不能过高，否则就不宜迅速凝固
8.切片可以将制作好的蜡块置于低温环境预冷，切出的切片连续性较好，有利于展片，一般切片厚度4-6um
（二）抗原修复
组织在制作过程中，由于固定液的作用封闭了抗原，又由于热的作用致使部分抗原的肽链发生扭曲，致使在免疫组化的染色过程中不能将其显示出来，为了解决上述的问题，利用化学试剂和热的作用将这些抗原重新暴露出来或修正过来的过程称为抗原修复。
北京博奥森常用的抗原修复液有：0.01M枸橼酸（pH6.0）、0.05M EDTA（pH8.0）、0.01M TBS（pH7.4）、胃蛋白酶、胰蛋白酶
北京博奥森常用的抗原修复方法：
方法1：沸水浴修复，将盛有修复液和玻片的烧杯置于沸水浴环境，保持外部沸腾状态15min，自然冷却至室温。
方法2：微波修复，将盛有修复液和玻片的烧杯置于微波炉中，高火5min，停火3min，中火5min，自然冷却至室温。
方法3：高压修复，修复液加入高压锅加热至沸腾，放入玻片，封盖加压持续加热至喷气时开始计时修复2min，自然冷却至室温。
方法4：使用胃蛋白酶修复，将胃蛋白酶修复液加入到组织上，37℃，消化30min
抗原修复，必须注意以下问题：
1、修复液的选择。
0.01M枸橼酸（pH6.0）：应用最多的抗原修复液，适用于大多数的抗原，用该液修复后的抗原表达增强，抗原的定性和定位很理想，结果不错;
0.05M EDTA（pH8.0）：应用较多的抗原修复液，修复能力较强，对于保存时间较长的切片或目的蛋白表达较弱的组织有很好的修复效果，需要控制好修复时间，否则容易出现较重的背景;
0.01M TBS（pH7.4）：中性修复液，适用于大多数抗原，对于核定位蛋白有较好的修复效果;
胃蛋白酶：应用较多的抗原修复液，适用于大多数的抗原，使用温度37℃，对于容易脱片的切片有很好的保护作用。
胰蛋白酶：应用较多的抗原修复液，适用于大多数的抗原
2.抗原热修复时应选择最佳温度。
据实验认为温度在92℃－98℃是合适的，尤其在95℃为最好，这是因为：（1）这种温度未达沸腾，切片不容易脱离载玻片；（2）能够解离和破坏与蛋白交联的甲醛醛键等，处理时可以随意选择和确定抗原修复的作用时间。如果选择高压修复，因为温度较高，时间不宜过长
3.抗原修复时有效温度所需持续时间根据各单位的设备条件以及使用的仪器不同，抗原修复时在有效的温度范围内所持续的时间也不一样。
4.抗原修复液必须遵循自然降温规律，否则效果不好或达不到抗原修复的目的。
5.尽量使用足量的抗原修复液，防止切片干涸。
6.切片必须附贴牢固，否则发生掉片。
（三）合适的抗体稀释度
抗体的浓度是免疫染色的关键，如果抗体浓度过高，抗体分子过多于抗原决定簇，可导致抗体结合减少，产生阴性结果。此阴性结果并不一定是缺少抗原，而是由于抗体过量，这种现象类似于凝集反应中的前带效应（prozone effect）。因此，必须使用一系列稀释做“棋盘式效价滴定”，检测抗体的合适稀释度，以得到最大强度的特异性染色和最弱的背景染色。抗体稀释度应根据：1.抗体效价高，溶液中特异性抗体浓度越高，工作稀释度越高；2.一般讲，应用的抗体稀释度越大，温育时间越长；3.对于抗体与非特异性蛋白的结合，只有高稀释度时才能防止其非特异性背景染色；4.稀释用缓冲液的种类，标本的固定和处理过程等也可影响稀释度，所以合适的稀释度应根据具体情况测定。抗体的稀释主要是指第一抗体，因为第一抗体中特异性抗体合适的浓度是关键，应用高稀释度第一抗体仅高亲和力的特异性染色反应，减少或消除其中交叉抗体反应。
（四）血清封闭，减少非特异性结合
组织中非抗原抗体反应出现的阳性染色称为非特异性背景染色，最常见的原因是蛋白吸附于高电荷的胶原和结缔组织成分上。最有效方法是在用第一抗体前加与制备第二抗体相同动物的非免疫血清（1:5-1:20），封闭组织上带电荷基团而除去与一抗非特异性结合。必要时加入2%-5%牛血清白蛋白，可进一步减少非特异性染色，作用时间为10-20min。免疫荧光染色时，可用0.01%伊文蓝（PBS溶液）稀释荧光抗体，对消除背景的非特异性荧光染色有很好的效果。洗涤用的缓冲液中加入0.85%-1%NaCl成为高盐溶液，充分洗涤切片，能有效的减少非特异性结合而减少背景染色。
（五）设置对照
其目的在于证明和肯定阳性结果的特异性，排除非特异性疑问。主要是针对第一抗体对照，常用的对照方法包括：1. 阳性对照；2. 阴性对照；3. 阻断实验； 4.替代对照；5. 空白对照；6. 自身对照；7. 吸收实验.
1. 阳性对照用已知抗原阳性的切片作对照与待检标本同时进行免疫组织化学染色，对照切片应呈阳性结果，成为阳性对照。证明全过程均符合要求，尤其当待检标本呈现阴性结果时，阳性对照尤为重要。
2.阴性对照用确证不含已知抗原的标本作对照，应呈阴性结果，成为阴性对照，是阴性对照的一种。其实空白、替代、吸收和抑制都属于阴性对照。当待检标本呈阳性结果时，阴性对照就更加重要，用以排除假阳性。
（五）显色观察
免疫酶染色应注意控制：
1. 呈色质浓度和反应时间。增加成色质的量和（或）增加底物反应时间，可增加反应产物强度；着色太深可减少反应时间。
2. 过氧化物酶显色时，H2O2浓度较大将使显色反应过快而至背景加深；过量H2O2可能抑制酶的活性。
（六）免疫组化结果的判断
对免疫组化结果的判断应持科学的慎重态度，要准确判断阳性和阴性，排除假阳性和假阴性结果，必须严格对照实验，对新发现的阳性结果，除有对照实验结果之外，应进行多次重复实验，可用几种方法进行验证。必须学会判断特异性染色和非特异性染色，对初学者更为重要，否则会得出不科学的结论。特异性染色和非特异性染色的鉴别点主要在于特异性反应产物常分布于特定的部位。如胞浆内，也有分布在细胞核和细胞表面的，即具有结构性。特异性染色表现为在同一切片上呈现不同程度的阳性染色结果。非特异性染色表现为无一定的分布规律，常呈某一部位成片的均匀着色，细胞和周围的结缔组织均无区别的着色，或结缔组织呈现很强的染色。非特异性染色常出现在干燥切片的边缘，有刀痕或者折叠的部位。在过大的组织块，中心固定不良也会导致非特异性染色。有时可见非特异性染色和特异性染色同时存在，由于过强的非特异性染色背景不但影响对特异性染色结果的观察和记录，而且令人对其特异性结果产生怀疑。
免疫组化的呈色深浅可反映抗原存在的数量，可作为定性、定位和定量的依据。
1.阳性细胞染色分布有三种类型：细胞浆、细胞核、细胞膜表面。大部分抗原见于细胞浆，可见于整个胞浆或部分胞浆
2.阳性细胞分布可分为灶型和弥漫性
3.由于细胞内含抗原量不同，所以染色强度不一。如果细胞之间染色强度相同，常提示其反应为非特异性
4.阳性细胞染色定位于单个细胞，且与阴性细胞相互交杂分布；而非特异性染色常不限于单个细胞，而是累及一片细胞。
5.切片边缘、刀痕或褶皱区域，坏死或挤压的细胞区，胶原结缔组织等，常表现为相同的阳性染色强度，不能用于判断阳性。
（七）染色失败的几种原因
1.所染的全部切片均为阴性结果，包括阳性对照在内，全部呈阴性反应，原因可能是：（1）染色未按严格操作步骤进行；（2）漏加一种抗体，或抗体失效；（3）缓冲液内含叠氮化钠，抑制了酶的活性；（4）底物中所加H2O2量少或失效；复染或脱水剂使用不当。
2.所有切片均呈弱阳性反应：（1）切片在染色过程中抗体过浓，或干燥了；（2）缓冲液配制中未加氯化钠或pH不准确，洗涤不彻底；（3）使用已变色的呈色底物溶液，或呈色反应时间过长；（4）抗体温育的时间过长；（5）H2O2浓度过高，呈色速度过快；（6）粘附剂太厚。
3.所有切片背景过深：（1）未用酶消化处理切片；（2）切片或涂片过厚；（3）漂洗不够；（4）底物呈色反应过久；（5）蛋白质封闭不够或所用血清溶血；（6）使用全血清抗体稀释不够。
4.阳性对照染色良好，检测的阳性标本呈阴性反应，固定和处理不当是最常见的原因。对于阳性结果的定量判断，常规方法是根据呈色深浅和阳性细胞数量分类计数，以（-）、+、++、+++等分级和计数统计。
